白癜风的治疗药物 http://m.39.net/pf/a_5727229.html研究背景
新型冠状病*严重急性呼吸系统综合征冠状病*2(SARSCoV-2)是当前全球爆发呼吸系统疾病COVID-19的原因。COVID-19的症状一般较轻，病死率较低，但与导致年严重急性呼吸系统综合症(SARS)爆发的相关冠状病*相比，传播速度更快。SARS-CoV-2基因组与SARS-CoV具有高度的序列同一性。两种病*都严重依赖病*蛋白酶的活性:主蛋白酶(非结构蛋白5(nsp5)中的Mpro/3CLpro)和木瓜样蛋白酶(nsp3的一部分PLpro)产生有功能的复制酶复合物，使病*得以传播。SCoV-PLpro也作为泛素和ISG15的蛋白酶，它们是已知的宿主先天免疫途径的调节剂，而抑制SCoV-PLpro可以阻止SARS-CoV复制。
研究结果
1.SARS-CoV-2PLpro优先裂解ISG15
尽管SCoV-PLpro和SCoV2-PLpro与MERS-PLpro密切相关且相距遥远，但纯化的SCoV-PLpro和SCoV2-PLpro显示出其底物偏好方面的差异，这是由于它们从中裂解了泛素或ISG15干扰素(IFN-α)处理的HeLa细胞中的底物。SCoV-PLpro大大降低了泛素化底物的涂片，对ISGylated底物的影响较小，而SCoV2-PLpro则优先降低了底物的ISGylation。作者采用了基于活性的探针(ABPs)，即与催化半胱氨酸形成共价键的丙炔酰胺(Prg)弹头，以及一个7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)探针，可切割并伴随荧光发射，从而能够监测蛋白酶活性动力学。SCoV2-PLpro优先与ISG15-Prg探针反应，但对K48连接的双泛素（K48-Ub2）和Nedd8的活性较弱，而对基于SUMO的Prg探针则无活性(图1a)。用K48-Ub2Prg探针观察到SCoV-PLpro的最强反应，与ISG15Prg探针的反应性较小(图1a)。通过增加K48-Ub2剂量的竞争测定进一步证实了这种底物偏好。在与SCoV-PLpro的反应中，K48-Ub2与ISG15-Prg或ISG15-AMC均能有效竞争，而竞争置换对SCoV2-PLpro的有效性差得多。还检查了两种PLpro的催化效率(kcat/KM)(图1b)，结果表明，SCoV2-PLpro介导的AMC从ISG15-AMC裂解确实比从K48-Ub2-AMC裂解AMC要好，而SCoV-PLpro从K48-Ub2裂解AMC的效率更高。有趣的是，在这些分析中，两种PLpro对ISG15的表观催化效率(kcat/KM)相似，但SCoV2-PLpro显示出略高的ISG15特异性(较低的KM，图1b)。与K48-Ub2相比，SCoV2-PLpro与ISG15的结合强度增加了20倍，而与K48-Ub2结合的SCoV-PLpro的亲和力比ISG15高10倍(图1c)。事实上，SCoV2-PLpro对基于Prg或AMC底物的去甲酰化酶活性与小鼠USP18(mUSP18)相似或更高，后者是一种特定的去乙酰化酶。两种PLpro酶对hyperneddylatedCUL1的去甲酰化活性也很弱，这是真正的去甲酰化酶DEN1的共同特征。综上所述，这些结果表明，在体外，SCoV-PLpro优先从底物上切割ISG15，而非泛素链和Nedd8，而SCoV-PLpro以泛素链为靶点，并在较小程度上切割ISG15和Nedd8(图1d)。
2.SCoV2-PLpro-ISG15结构分析
为了深入了解SCoV2-PLpro-ISG15特异性的分子基础，作者确定了SCoV2-PLpro(C11S)-小鼠ISG15复合物的晶体结构(图2a)。值得注意的是，ISG15显示两个串联的泛素样折叠。SCoV2-PLpro和两个ISG15域的整体组装类似于MERS-PLpro-humanISG15复合物(PDBID:6BI8)。催化半胱氨酸残基在SARS中也保持不变。与ISG15本身的晶体结构（PDBID:5TLA）相比，ISG15的N端半部分旋转了近90°，位于SCoV2PLpro的S2螺旋线上(图2b)。具有mISG15-C-term的配合物中SCoV-PLpro的结构(PDBID:5TL7)表明，SCoV-PLpro和SCoV2-PLpro与mISG15的C-lobe具有相同的结合模式。接下来，作者将SCoV2-PLpro-ISG15复合体的结构与和K48-Ub2结合的SCoV-PLpro的结构进行了比较，其近端泛素连接到催化位点。这两种复合物的主要区别在于其与远端催化位点的相互作用，即蛋白酶S2位点与远端K48链上的泛素结合，或与ISG15中的N端泛素样折叠结合。当SCoV-PLpro-Leu76介导泛素上与Ile44的疏水相互作用时，SCoV2-PLpro上对应的残基是Thr75(图2c）。为了模拟在SCoV-PLpro中观察到的疏水相互作用，作者生成了SCoV2-PLpro的两个变体(T75A和T75L)。有趣的是，T75L突变导致K48-Ub2-AMC断裂，而T75A没有(图2d)。这表明适当大小的疏水残基是泛素结合的关键决定因素。作者还比较了来自其他冠状病*的木瓜蛋白酶样蛋白酶(PLP)，包括常见的人类冠状病*OC43、E和NL63。有趣的是，PLPs中的S2结合位点在冠状病*中的保守性较差，并且在SCoV2-PLpro的Thr75位点上表现出疏水性的变异性，这可能会影响底物的特异性。
接下来，作者检查了其他SCoV2-PLpro残基是否有助于增强ISG15亲和力。SCoV2-PLpro-Val66面向ISG15N-端泛素折叠域上的疏水性补丁(Ala2，Thr20，Met23)(图2e)。有趣的是，两种PLpro酶共享Phe(SCoV2-PLpro-Phe69和SCoV-PLpro-Phe70)作为核心残基，介导与泛素或ISG15的疏水相互作用。与野生型相比，在SCoV2-PLpro上突变的Phe69(F69A)或Val66(V66A)显著降低了其酶活性，并且与ISG15-Prg反应较慢(图2f)。
还使用分子动力学(MD)模拟检查了SCoV2PLpro与K48-Ub2和mISG15之间的相互作用。多微秒MD模拟证实，与K48-Ub2相比，SCoV2-PLpro与ISG15的相互作用更紧密(再次确认图1e中测量的Kd值)。在3次分别为3.2μs的独立运行中，mISG15与SCoV2-PLpro:mISG15X射线结构相同。相比之下，K48-Ub2的远端泛素在微秒级的6次运行中有4次从SCoV2-PLpro中分离出来。结果发现L75T是SCoV2-PLpro和SCoV-PLpro之间的区别，因为它削弱了结合界面上的疏水性簇。观察到水在解离前短暂进入Ile44Ub和Thr75CoV2之间。实际上，在用K48-Ub2模拟SCoV-PLpro双突变体(S67V/L76T)时，观察到类似的水介导的解离机制。综上所述，这些结果表明S2区决定了底物的特异性，并且SCoV2-PLpro相对优先于ISG15。
3.GRL-是SCoV2-PLpro的抑制剂
随着寻找新的抗COVID-19治疗策略的迫切需要，作者测试了SCoV-PLpro非共价抑制剂GRL-对SCoV2-PLpro的影响(图3a)。GRL-是一种针对SCoV-PLpro开发的基于萘的抑制剂，不抑制其他宿主蛋白酶。基于GRL-和其他已知萘抑制剂与SCoV-PLpro的结合模式，作者假设SCoV2-PLpro保守的Tyr也可以结合GRL-并阻止ISG15C-端进入蛋白酶催化裂缝(图3b)。实际上，GRL-到SCoV2PLpro的IC50与SCoVPLpro的IC50相似(图3c)。有趣的是，这种抑制剂对MERS-PLpro无效。作者假设这可能是由于在这个保守位置存在Thr而不是Tyr。因此，在SCoV2-PLpro中将Tyr突变为Thr(YT)或Gly(YG)强烈降低了GRL-的抑制作用(图3c)，表明了Tyr在该过程中的关键作用。用SCoV-PLpro和SCoV2-PLpro对GRL-的MD模拟进一步证实了GRL-和Tyr(SARS的Tyr)之间的共同结合模式。
为了评估GRL-对COVID-19的治疗价值，作者检测了GRL-对宿主蛋白SCoV2-PLpro脱乙酰酶或deu-biquitinase活性的影响。GRL-有效地阻断了SCoV2-PLpro，导致IFN-α处理的细胞裂解物中ISGylated蛋白水平增加。GRL-还阻断了SCoV-PLpro的脱氮活性。有趣的是，GRL-对Prg探针与SCoV2-PLpro之间反应的影响在ISG15C-term-Prg比ISG15FL-Prg或泛素与K48-Ub2到SCoV-PLpro之间的反应更显著，与结构数据一致，表明ISG15N-端泛素折叠域之间的相互作用增强了与SCoV2PLpro的交互。结果表明，GRL-对SCoV2-PLpro和SCoV-PLpro均有抑制作用。
4.PLpro调节IFN和NF-κB通路
为了了解SCoV2-PLpro和SCoV-PLpro在病理生理作用上的差异，扩大对SARS-CoV-2蛋白相互作用图谱的认识，作者分析了这两种蛋白的细胞相互作用组。ISG15在与催化不活跃的SCoV2-PLpro(C11S)的复合物中显著富集，而SCoV-PLpro突变体(C11S)主要与泛素相关(图4a，b)。在I型IFNs处理的哺乳动物细胞中，未结合的ISG15和ISG15阳性涂片(可能代表了ISGylated底物)的免疫沉淀在GFP-SCoV-PLpro(CS)中比在GFP-SCoV-PLpro(CS)中更明显(图4c)。这种联系在GRL-治疗后被阻断(图4c)。此外，这些密切相关的PLpro酶与不同的和特定的宿主蛋白组相关联(图4a)。对于SCoV2-PLpro，包括与Ⅰ型干扰素诱导相关的PRKDC；参与宿主RNA剪接的异源核核糖核蛋白K(HNRNPK)，这是SARS-CoV-2在细胞内复制的重要过程；Galectin1，它可以在HIV感染期间诱导病*与靶细胞融合(图4a)。相比之下，SCoV-PLpro与几种丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpins)密切相关，包括serpinb3，被提议用来抑制木瓜蛋白酶。有趣的是，SERPINB3和PLpro酶的表达部分恢复了表达SCoV-PLpro的细胞中的NF-κB信号，但对SCoV2-PLpro调节IFN途径没有影响。
在IFN-α刺激后，哺乳动物细胞中SCoV2-PLpro和SCoV-PLpro的表达减少了细胞蛋白质的ISGylation，包括干扰素调节因子3(IRF3)的表达，后者是Ⅰ型干扰素途径中的关键组分。SCoV2-PLpro和SCoV-PLpro均导致IRF3ISGylation的丢失，其中SCoV2-PLpro的强度更大(图4d)。在SCoV-PLpro或SCoV2-PLpro表达时检测到TBK1、IRF3的磷酸化降低和IRF3的核移位。与SCoV-PLpro催化突变体(C11S)相比，SCoV2-PLpro催化突变体(C11S)对IRF3磷酸化表现出更强的显性负性效应。TBK1磷酸化也激活NF-κB通路，引起炎症信号的上调。尽管SCoV-PLpro的表达对IRF3ISGylation的影响较小(图4d)，但它强烈地减弱了IκB-α的降解。SCoV-PLpro还导致TNF-α处理细胞p65的核转位严重减少。
Poly(I:C)处理模拟病*核酸的感应，诱导IFN-β的表达。在poly(I:C)处理后，与SCoV-PLpro相比，SCoV2-PLpro的表达更有效地降低了IFN-β启动子的激活水平。这两种PLpro酶的抑制作用被GRL-处理所中和。相比之下，SCoV-PLpro的表达主要阻断了TNF-α诱导的NF-κB-p65的表达，这对GRL-治疗也很敏感。总之，作者展示了两种密切相关的冠状病*(SARS和SARS-CoV-2)是如何利用它们的PLpro酶不同地对抗宿主免疫系统的。
5.PLpro抑制影响病*传播和IFN反应
研究表明GRL-抑制SARS冠状病*的复制。因此，为了确定抑制SCoV2-PLpro是否也能阻止SARS-CoV-2的复制，CaCo-2细胞被SARS-CoV-2感染并用GRL-处理(图5a)。用细胞病变抑制法检测GRL-的作用。结果显示在GRL-存在下，SARS-CoV-2诱导的CPE逐渐受到剂量依赖性抑制，μM的GRL-显示出接近%的CPE抑制作用(图5b)。此外，GRL-治疗减少了病*的活性复制(编码E基因的SARS-CoV-2亚基因组RNA4)，这是通过细胞内病*RNA产生的遗传监测来测量的(图5c)。因此，在GRL-治疗后，也观察到病*颗粒从受感染细胞释放到上清液中的减少(图5d)。这表明GRL-介导的抑制SCoV2-PLpro阻碍了病*复制，从而减弱了正在进行的病*RNA合成。
已经证明了SCoV2-PLpro和SCoV-PLpro表达在抑制宿主抗病*IFN途径中的作用，他们预计GRL-抑制也可以逆转这一过程。事实上，GRL-对SARS-CoV-2感染细胞的治疗导致IRF3ISGylation显著增加(图5e)，这一点以前已经被证明可以调节抗病*免疫反应。此外，在GRL-治疗后，SARS-CoV-2感染细胞的IRF3和TBK1的磷酸化(IFN通路激活的标记物)和p65磷酸化(用于监测NF-κB通路的激活)均增加(图5f)。重要的是，GRL-治疗显著挽救了SARS-CoV-2感染细胞中IFN应答基因(ISG15、OAS1、PKR、MX1)的表达水平(图5g)。这些发现提供了证据，抑制SCoV2-PLpro除了阻断病*RNA合成外，还可以通过TBK1和IRF3增加抗病*信号。虽然用GRL-进行的实验提供了证据支持药物靶向SCoV2-Plpro对患者的治疗价值，但鉴于其低效性，还需要进一步的研究以开发更有效和选择性的PL-pro抑制剂。
最后，作者检测了CaCo-2细胞在SARS-CoV和SARS-CoV-2感染后的变化。GRL-对感染细胞的治疗在I型IFN和NF-κB途径的生化和转录参数上有一个整体相似的模式(图5e-g)。然而，有趣的是，他们发现GRL-在恢复IRF3的ISGylation和磷酸化水平以及在SARS-CoV-2感染时IFN应答基因的表达方面比SARS-CoV更有效(图5e-g)。相比之下，在这个上皮细胞培养模型中，SARS-CoV和SARS-CoV-2之间促炎细胞因子IL-6和IL-8的转录水平相似(图5g)。与这些观察结果一致，最近的一项研究表明，在动物模型和COVID-19患者中，SARS-CoV-2感染与低IFNⅠ型和Ⅲ型反应相关。尽管SCoV2-PLpro对去甲酰化的选择性活性可能导致I型IFN信号的降低，但还需要更详细的研究来了解控制SARS-CoV和SARS-CoV-2感染不同病理结果的先天性和适应性免疫的关键调控因素。
总结
综上所述，这项跨学科研究提供了对SARS-CoV-2感染过程中SCoV2-PLpro功能的机理性理解，并将SCoV2-PLpro确立为治疗COVID-19的一个有希望的靶点。新近发现的SCoV2-PLpro抑制剂可能导致新型抗COVID-19疗法的快速发展，其具有阻断SARS-CoV-2传播和提高宿主抗病*免疫的双重作用。此外，SARS-CoV-2的主要蛋白酶作为一种潜在的抗COVID-19的药物靶点一直是人们
